質(zhì)量可控是活性化合物成藥及進行藥品安全有效性評價的前提。對藥品的質(zhì)量進行控制應(yīng)該是多方面的，其中包括生產(chǎn)環(huán)境的控制、原輔料來源和質(zhì)量的控制、生產(chǎn)工藝過程的控制，以及按照質(zhì)量標準進行成品檢驗控制等。

但是，在藥品研發(fā)過程中，揭示藥品的品質(zhì)、控制藥品的質(zhì)量，通常是要針對研制藥品的特性(主藥的理化性質(zhì)及制劑的質(zhì)量要求等)確定相應(yīng)的研究測試項目，再根據(jù)測試項目的需要，建立適宜的分析方法(包括方法的選擇和方法的驗證)，最后是根據(jù)藥品質(zhì)量的要求及安全性研究結(jié)果確定各測試項目的限度，起草制訂檢驗藥品質(zhì)量的質(zhì)量標準。

分析方法是揭示藥品品質(zhì)的工具和手段，方法驗證是判斷采用的分析方法是否科學、可行的過程。實際上，方法驗證就是根據(jù)確定的檢測項目的要求，預先設(shè)置一定的驗證內(nèi)容，并通過設(shè)計合理的試驗來驗證所采用的分析方法能否符合檢測項目的要求。

下面就根據(jù)《化學藥物質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)指導原則》解讀分析方法驗證的內(nèi)容和評價要點，在對目前申報資料中分析方法驗證工作中存在的問題進行分析的基礎(chǔ)上，以高效液相色譜法為例，闡述方法驗證的思路及驗證要點，希望能對藥物研發(fā)者有所幫助。

首先應(yīng)該明確的是：方法驗證的內(nèi)容應(yīng)根據(jù)檢測項目的要求，同時結(jié)合所采用的分析方法的特點確定。相同的分析方法用于不同的檢測項目時，其驗證要求是不同的。例如，采用高效液相色譜法用于制劑的鑒別和雜質(zhì)定量檢查時的驗證要求是不同的；

前者重點要驗證方法的專屬性，而后者重點要驗證方法的專屬性、準確度和定量限。通常需要驗證的檢測項目：鑒別、雜質(zhì)檢查(限度試驗、定量試驗)、定量測定(含量測定、溶出度、釋放度等)，還有其他特定的檢測項目(粒徑分布、分子量分布)等。方法驗證的內(nèi)容包括專屬性、線性、范圍、準確度、精密度、檢測限、定量限、耐用性(粗放度)和系統(tǒng)適用性等。

1.2線性

線性系指在設(shè)計的測定范圍內(nèi)，檢測結(jié)果與供試品中被測物的濃度(量)直接呈線性關(guān)系的程度，是定量測定的基礎(chǔ)，涉及定量測定的項目，如雜質(zhì)定量試驗和含量測定均需要驗證方法的線性。

1.3范圍

范圍系指能夠達到一定的準確度、精密度和線性，測試方法適用的試樣中被測物高低限濃度或量的區(qū)間。通常用與分析方法的測試結(jié)果相同的單位(如百分濃度)表達。涉及到定量測定的檢測項目均需要驗證范圍，如含量測定、含量均勻度、溶出度或釋放度、雜質(zhì)定量試驗等。范圍應(yīng)根據(jù)劑型和(或)檢測項目的要求確定。含量測定范圍應(yīng)為測試濃度的80%～100%或更寬。制劑的含量均勻度范圍應(yīng)為測試濃度的70%～130%。

1.4準確度

準確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或認可的參考值之間接近的程度。具有一定的準確度是進行定量測定的必要條件，因此，涉及到定量測定的檢測項目均需要驗證方法的準確度，如含量測定、雜質(zhì)定量試驗等。準確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立。

1.5精密度

精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一均質(zhì)供試品經(jīng)多次取樣進行一系列檢測所得結(jié)果之間的接近程度(離散程度)。一般用偏差、標準偏差或相對標準偏差表示。精密度可以

從3個層次考察：重復性(同樣的操作條件下，在較短時間間隔內(nèi)，同一分析人員測定結(jié)果的精密度)、中間精密度(同一實驗室，不同時間、不同分析人員、不同儀器設(shè)備測定結(jié)果的精密度)、重現(xiàn)性(不同實驗室、不同分析人員測定結(jié)果的精密度，當分析方法被法定標準采用時，應(yīng)進行重現(xiàn)性試驗)。

檢測限系指試樣中的被測物能夠被檢測到的zui低量，但不一定要準確定量。該驗證指標的意義在于考察方法是否具備靈敏的檢測能力。因此，對雜質(zhì)限度試驗，需驗證并證明方法具有足夠低的檢測限，以保證檢出需控制的雜質(zhì)。

定量限系指試樣中的被測物能夠被定量測定的zui低量，其測定結(jié)果應(yīng)具有一定的準確度和精密度。它體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質(zhì)定量試驗，需驗證方法的定量限，以保證含量很少的雜質(zhì)能夠被準確測定。

1.8耐用性

(粗放度)耐用性系指測定條件發(fā)生小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。主要考察方法本身對于可變試驗因素的抗干擾能力。典型的變動因素包括：液相色譜法中流動相的組成、流速和pH值、不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫等。

對一些儀器分析方法，在進行方法驗證時，有必要將分析設(shè)備、電子儀器與實驗操作、測試樣品等一起當作完整的系統(tǒng)進行評估。系統(tǒng)適用性便是對整個系統(tǒng)進行評估的指標，其試驗參數(shù)的設(shè)置需根據(jù)被驗證方法類型而定。色譜方法對分析設(shè)備、電子儀器的依賴程度較高，因此，所有的色譜方法均應(yīng)進行系統(tǒng)適用性驗證，并將該指標作為分析方法的組成部分。

2.1方法驗證的評價要點

方法驗證的評價應(yīng)圍繞驗證目的進行，同時關(guān)注方法驗證內(nèi)容的全面性和試驗方案的系統(tǒng)性和合理性，以及驗證過程的規(guī)范性。

2.2方法驗證需要關(guān)注的問題

2.2.1雜質(zhì)定量方法驗證

雜質(zhì)定量試驗要驗證方法的專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍、準確度、精密度等。為考察方法能否有效檢出原料藥或制劑中的雜質(zhì)，可采用原料藥尚未精制的粗品、或加入合成中間體的方法;還可根據(jù)藥物的化學結(jié)構(gòu)特點、制劑的處方與工藝、貯藏條件等選用合適的酸、堿、光、熱、氧化等強制破壞性試驗來驗證方法的專屬性；

注意進行破壞試驗的條件要適度，著重考察敏感條件，即不能無降解產(chǎn)物產(chǎn)生，也不能將主藥成分破壞殆盡，應(yīng)以主藥成分破壞20%～30%為宜；否則，無降解產(chǎn)物產(chǎn)生或主藥成分破壞殆盡時進行的專屬性試驗是不能反映擬定的方法能有效將主藥與雜質(zhì)分開并能有效檢出可能的雜質(zhì)的。

另外，在進行方法專屬性試驗時，還可采用二極管陣列檢測器、質(zhì)譜檢測器等檢測峰純度；因在強制降解試驗條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物較藥品貨架期產(chǎn)生的降解產(chǎn)物復雜、未知雜質(zhì)多，分離難度大，二極管陣列檢測器和質(zhì)譜檢測器可有效顯示各色譜峰的純度，以免因分離度不符合要求，導致分析結(jié)果不準確。

如果不具備檢測峰純度的試驗條件，也可通過調(diào)整流動相的組成或比例的方法使各色譜峰的相對保留時間發(fā)生改變，來印證雜質(zhì)檢查方法的專屬性。對雜質(zhì)定量方法驗證進行評價，需要關(guān)注的問題還有雜質(zhì)的定量方法。通常，雜質(zhì)的定量方法有①外標法(雜質(zhì)對照品法)。②加校正因子的主成分自身對照法。③不加校正因子的主成分自身對照法。④峰面積歸一化法。

雜質(zhì)對照品法定量比較準確，是進行雜質(zhì)有效控制的最直接的方法，建議已知雜質(zhì)控制盡量采用雜質(zhì)對照品法定量;此時，還應(yīng)對對照品進行評估和確認，制訂質(zhì)量控制要求。

加校正因子的主成分自身對照法應(yīng)對校正因子進行嚴格測定，該方法適用于相對響應(yīng)因子在0.5～1.5范圍內(nèi)的已知雜質(zhì)的控制;超出0.5～1.5范圍時，宜采用雜質(zhì)對照品法或調(diào)整檢測波長使雜質(zhì)的相對響應(yīng)因子落在0.5～1.5范圍內(nèi)。

不加校正因子的主成分自身對照法的前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同;相對響應(yīng)因子在0.9～1.1范圍內(nèi)，可以采用主成分自身對照法，超出0.9～1.1范圍時，宜采用雜質(zhì)對照品法或加校正因子的主成分自身對照法。峰面積歸一化法簡便快捷，但是，因各雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子有差異、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線性范圍內(nèi)、儀器對微量雜質(zhì)和常量主成分的積分精度及準確度不相同等因素影響定量的準確性，一般不建議采用。

 2.2.2復方制劑雜質(zhì)研究的考慮要點

復方制劑雜質(zhì)的來源及種類較單方制劑復雜，其雜質(zhì)的分離檢出、定性及定量研究工作是該類制劑質(zhì)量控制研究的重點和難點，也是在評價過程中出現(xiàn)問題較多、經(jīng)常需要以補充資料的形式完善的研究內(nèi)容。

復方制劑雜質(zhì)的檢查方法應(yīng)兼顧不同來源的雜質(zhì)(原料藥制備過程引入的雜質(zhì)、制劑過程和/或貯藏期間的降解產(chǎn)物)，重點監(jiān)控穩(wěn)定性較差藥物的降解產(chǎn)物及有毒或有害雜質(zhì)。進行復方制劑的雜質(zhì)研究，首先要分析各雜質(zhì)的來源，采用適當?shù)姆椒▽﹄s質(zhì)進行定性研究和歸屬。

由于主藥及其雜質(zhì)的理化性質(zhì)的差異可能較大，色譜行為的差異也較大，故一般要采用梯度洗脫或多種色譜條件。在采用紫外檢測器時，應(yīng)選用對各雜質(zhì)均有較強吸收的波長作為檢測波長;當一個測定波長無法兼顧所有雜質(zhì)時，可選用不同波長分別進行測定。采用不同的色譜條件分別考察各主藥的雜質(zhì)時，專屬性研究既要考察溶劑、輔料是否對被測主藥的雜質(zhì)檢測有影響，也要考察其他主藥及其雜質(zhì)是否對該條件下被測主藥的雜質(zhì)檢測有影響。

在同一色譜條件下同時考察各主藥的雜質(zhì)時，專屬性研究應(yīng)考察溶劑、輔料是否對各雜質(zhì)檢測有影響，各主藥峰及各雜質(zhì)峰是否能有效分離，各雜質(zhì)是否能明確歸屬。復方制劑中的毒性雜質(zhì)及已知雜質(zhì)，應(yīng)采用雜質(zhì)對照品法進行定量測定。若采用加校正因子的主成分自身對照法，應(yīng)注意不同時間、不同儀器、不同實驗室間相對保留時間的波動，以及當供試品中存在多個雜質(zhì)而分離度又較差時可能造成的雜質(zhì)定位的困難。

2.2.3方法再驗證

在某些情況下，如原料藥的合成工藝改變、制劑的處方改變、分析方法發(fā)生改變等，均需要對分析方法再次進行全面的或部分的驗證，以確保分析方法可行，適用于變更后產(chǎn)品的質(zhì)量控制，這一過程稱為方法再驗證。進行變更研究和仿制藥研制時需特別注意要進行方法再驗證工作。

當原料藥的合成工藝發(fā)生改變時，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法的專屬性就需要重新進行驗證，以證明雜質(zhì)檢查方法能夠檢測新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對主成份的含量測定無干擾。

當制劑的處方發(fā)生變更時，可能會影響鑒別方法的專屬性、溶出度和含量測定的準確度，此時，需要對鑒別、含量測定方法進行再驗證。當原料藥來源發(fā)生變更時，可能會影響雜質(zhì)檢查和含量測定的專屬性和準確度，因此，需要對雜質(zhì)檢查方法和含量測定方法進行再驗證。

當某一項目的分析方法發(fā)生改變時，如采用高效液相色譜法測定含量的檢測波長發(fā)生改變，則要重新進行檢測限、專屬性、準確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗證，同時還應(yīng)進行方法改變前后所得結(jié)果的對比研究，證明變更后的方法合理、可行。在進行仿制藥研究時，其所用原料藥的合成工藝、制劑處方中的輔料等可能與已上市藥品不同，此時，不僅要對質(zhì)量標準中部分項目進行方法再驗證，還應(yīng)對根據(jù)研制品種質(zhì)量控制需要增加的測試項目所用的方法進行驗證。

方法驗證是藥品質(zhì)量控制研究重要的組成部分，通常要貫穿藥品研發(fā)的始終。方法驗證應(yīng)圍繞驗證目的，根據(jù)測試項目的要求，結(jié)合所用分析方法的特點確定相應(yīng)的驗證內(nèi)容;同時要注意驗證試驗的過程應(yīng)嚴謹、規(guī)范。另外，隨著藥品研發(fā)的進展及在研發(fā)過程中的變更情況進行必要的方法再驗證，以不斷完善分析方法，同時適用于變更后產(chǎn)品的質(zhì)量控制。